Wetenschappers werken hard om proefdieren – op zijn minst deels – te vervangen door proefbuizen en computers. ‘We willen een blauwdruk maken waar andere onderzoekers mee aan de slag kunnen.’
Julen Sanz Serrano en Andrés Tabernilla zijn geconcentreerd bezig in het donkere lab. Beide Spanjaarden werken als postdoc in de onderzoeksgroep in-vitrotoxicologie van de VUB. Ze zoeken hoe ze met culturen van menselijke cellen de toxiciteit van chemische stoffen voor de lever en de werking van geneesmiddelen voor leverziekten kunnen detecteren.
‘Sorry dat het hier zo donker is’, verontschuldigt Tabernilla zich. ‘Da’s vast niet goed voor je foto’s. Maar we werken met fluorescentie en die is veel minder intens wanneer het licht aan is. De machine detecteert de cellen dan minder goed.’
De machine is een flowcytometer, ‘met twee lasers, zo kunnen we met twee kleuringen werken. Een kleintje’, volgens Sanz Serrano, hoewel het toestel het formaat heeft van een Amerikaanse koelkast. ‘Er bestaan er zo groot als dit lab, met vijf lasers.’
Een flowcytometer is een toestel om naar de fysische eigenschappen van cellen te ‘kijken’. De cellen zitten in een vloeistof die een capillair buisje opzuigt. Het buisje is zo dun dat de cellen er maar een voor een door kunnen. Zo scant de laser ze, ‘zoals je boodschappen doet in de supermarkt, maar dan veel sneller’, zegt de farmacoloog lachend. ‘Deze scant honderd tot duizend gebeurtenissen per seconde.’
Al babbelend werken de onderzoekers verder. Tabernilla vertelt wat hij aan het doen is. ‘Met de flowcytometer kijk ik of de cellen in rustfase zijn, of ze gestopt zijn met hun normale celcyclus en niet meer delen. Ik doe onderzoek naar stoffen die cholestase veroorzaken, een opstapeling van gal in de lever. Die stoffen brengen levercellen in een senescente staat, een soort van eeuwigdurende rustfase. Het is nog maar de eerste stap in het onderzoek, alles draait nog om verbanden.’
Ondertussen is duidelijk dat de analyse van het eerste monster mislukt is. De mannen zijn niet onder de indruk. ‘Normaal! Iedere wetenschapper die iets anders beweert, liegt. Je moet eerst de machine instellen en alles perfectioneren. Het is zoals de eerste pannenkoek, die mislukt ook altijd’, zegt Tabernilla. ‘En wie moet die opeten?’ Sanz Serrano weer: ‘De mama, altijd de mama.’
Dier doden
Hun chef, Mathieu Vinken, grijnst. ‘Ik heb een stel bijzondere medewerkers. Dat moet ook wel, als je ziet wat ze hier allemaal moeten doen. Ik geniet ervan om hen te zien groeien in hun taken.’ De apotheker-toxicoloog heeft de leiding over ONTOX, een vijfjarig project gefinancierd door de Europese Commissie.
Vinken knikt. ‘Er zitten een twintigtal mensen in mijn team. Sommigen komen net van de universiteit, en van mij moeten ze meedraaien. Ze worden meteen blootgesteld aan de werkelijkheid, met de regelgevers en de bedrijven. Niet het typische academische doctoraat.’
Klassiek doet het lab in-vitrotoxicologie, vrij vertaald: onderzoek naar giftigheid in reageerbuisjes. ‘We zouden ook in silico in onze naam moeten zetten, dat staat voor onderzoek met computermodellen. In silico naar de siliciumchips van een computer. We ontwikkelen NAMs.’
NAM is de afkorting van New Approach Methodology, de NA staat dus niet voor Non-Animal. ‘Al is dat wel het uiteindelijke streefdoel. Hoewel, ik moet mij preciezer uitdrukken. Zowel in ons lab als in het ONTOX-project willen we een Proof of Concept creëren. We willen aantonen dat je het aantal dierproeven drastisch kan verminderen als je het anders aanpakt.’
Wetenschappers komen niet graag in beeld als het over dierproeven gaat, en Vinken begrijpt dat. ‘Je kan geen legale dierproef meer doen zonder ze goed te doen, en de goedkeuring krijgen is niet gemakkelijk. Je gaat geen muis méér doden dan strikt nodig. Terecht! Maar dan nog: een dier doden, dat voelt nooit goed.’
Factor honderd
De meest recente cijfers van proefdiergebruik in de EU (inclusief Noorwegen) dateren van 2019. Toen werden 10,4 miljoen proefdieren gebruikt. België stond op plaats 7, met een kleine 500.000 dieren. ‘Niet om trots op te zijn, gezien de geringe grootte van ons land’, zegt Vinken.
Een kleine twintig procent van de proefdieren werd ingezet omdat wetten of regelgeving dat zo voorschrijven. De overige dieren zetten wetenschappers in voor fundamenteel en toegepast onderzoek. ‘Het proefdierenverbruik daalt, maar niet snel. Vorige week las ik nog een studie die uitgerekend had dat we aan dit tempo honderd jaar nodig hebben om proefdierengebruik in Europa te minimaliseren.’
Waarom voeren we eigenlijk dierproeven uit? Daarover is Vinken heel stellig: ‘Dierproeven zijn begonnen omdat er niet beter was!’ Al decennialang dienen mensen chemische stoffen bestemd voor mensen eerst toe aan een dier, meestal een rat of een muis. ‘Dan kijken ze bij welke dosis er een schadelijk effect is, en dan extrapoleren ze dat naar de mens, meestal met een extra veiligheidsfactor van honderd.’
Dat is tien keer voor de verschillen tussen muis en mens, en dan nog eens tien keer voor het verschil tussen mensen onderling. ‘Je voelt het aan: dat is nattevingerwerk. De kinetiek van stoffen kan compleet verschillen tussen diersoorten: wat doet een stof met het lichaam, en ook: wat doet het lichaam met een stof?’
Maar ook het voorbehoud tegenover dierproeven en de zoektocht naar alternatieven gaan al een hele tijd mee. ‘In 1959 was er al een mijlpaal. Toen publiceerden William Russell en Rex Burch het boek The Principles of Humane Experimental Technique. Daaruit komen de drie V’s: verfijning, vermindering en vervanging van diertesten.’
Verfijning staat voor alles wat dieren minder doet lijden, volgens Vinken. ‘Dat zijn pijnstillers, speeltjes in de kooien zodat ze ontspannen, gewenning aan de omgeving, noem maar op.’ Het woord vervanging spreekt voor zich. ‘Dierproeven vervangen door andere testen, zoals celculturen, of meer recent door computermodellen.’
Vermindering is volgens hem een aanpak die op korte termijn resultaat kan boeken. ‘Dat kan bijvoorbeeld door het statistische ontwerp van je proef heel doordacht aan te pakken, zodat je het aantal proefdieren tot een minimum beperkt. En vandaag zijn we nog niet in staat om alle dierproeven volledig te vervangen, maar we kunnen wel een aantal aspecten ervan vervangen.’
Geen kleine mens
Er zijn ook verschillende redenen waarom we – op zijn minst in Europa, maar stilaan ook wereldwijd – van dierproeven af willen. ‘Ten eerste vanwege de ethiek. Dierenrechtenorganisaties strijden tegen dierenleed, en dat is ook waarom de meeste mensen dierproeven niet graag zien. Met een leven spelen voelt niet oké, ook al hebben mensen meestal niet zo veel affiniteit met muizen of ratten.’
Dierenleed was een belangrijk argument bij het totaalverbod op dierproeven voor cosmetica door de EU in 2013. Vinken lacht bij de herinnering. ‘Dan kreeg je die typische reactie van mannen: wat heb ik daaraan, ik gebruik toch geen cosmetica? Weet je dat de gemiddelde man zeven cosmeticaproducten gebruikt voor hij ’s morgens het huis uitgaat? Tandpasta, deodorant en scheerschuim horen daar ook bij, hoor!’ Al was het dan een belangrijke stap, het effect op het proefdierverbruik van dat verbod is klein. ‘Maar een klein deel van de proefdieren in Europa werd ingezet voor cosmeticatesten.’
Een andere reden, die vooral de farma-industrie aanvoert, is financieel. ‘Een geneesmiddel ontwikkelen kost tot anderhalf miljard euro. Het duurt tien tot vijftien jaar, en daarna is er nog steeds negentig procent kans dat het van de markt wordt gehaald omdat er iets gebeurt wat je niet kon voorspellen. Dus de farma is op zoek naar iets wat haar vroeger kan zeggen wat geen goede kandidaat is.’
Vinken zelf ziet nog een belangrijke reden: de wetenschap. ‘Een rat is geen kleine mens. Terwijl we dat wel aannemen als we dierproeven doen, met een factor honderd voor de veiligheid. Maar we weten ondertussen dat er veel mechanismen zijn die anders verlopen. Kijk naar het verleden: softenon (thalidomide, red.). De gevolgen voor de kinderen van vrouwen die dat tijdens hun zwangerschap slikten, doken niet op in dierproeven. Dat is een extreem geval, maar niet het enige geval in de geschiedenis.’
Om zeker te zijn van de effecten bij mensen, moet je met menselijk materiaal werken. Je kan daarbij natuurlijk niet zomaar dieren door mensen vervangen in de proeven. ‘Vraag maar eens aan mensen of zij als eerste een medicijn willen nemen dat niet getest is op proefdieren. Wie zegt daar ja op?’ Dierproeven zou je dus kunnen zien als een noodzakelijk kwaad.
Lever op een chip
Maar er zijn alternatieven, en die zoekt Vinken. ‘In ON-TOX willen we voor lever, nieren en hersenen voor telkens twee schadelijke effecten dierproeven vervangen door een combinatie van andere methoden. Die zes voorbeelden moeten bewijzen dat het kan, en moeten andere onderzoeksgroepen een blauwdruk geven om zelf aan de slag te gaan. In ons lab focussen wij op de lever, het antigifcentrum van ons lichaam.’
In het leveronderzoek zijn de schadelijke stoffen steatotisch – ‘ze veroorzaken een opstapeling van vet’ – of cholestatisch – ‘ze veroorzaken een opstapeling van gal’. Het alternatief voor dierproeven zal moeten bestaan uit een hele batterij aan testen. ‘Je mag er niet vanuit gaan dat we een dierproef vervangen door een simpele test. Dat is naïef. We moeten eerst goed begrijpen hoe alle reacties mechanistisch functioneren, en dan gaan we de proeven vervangen door een platform van verschillende testen.’
‘Je mag er niet van uitgaan dat we een dierproef vervangen door een simpele test. Dat is naïef’
Het VUB-lab werkt met culturen van volwassen menselijke levercellen. ‘We spreken van primaire cellen. Als bijvoorbeeld iemand om het leven komt bij een ongeval, en de lever is nog goed en niet nodig voor transplantatie, dan kunnen wij daar cellen uit isoleren voor onze culturen.’
Zo’n model is niet zomaar een petrischaaltje met wat levercellen erin. ‘Wij maken een driedimensionale sferoid-cultuur, die veel eigenschappen van de lever heeft, en die ook lang blijft bestaan. Zo kunnen we langetermijneffecten van stoffen testen, die zijn toxicologisch het interessantst.’
In-vitrotoxicologie kan ook met geïnduceerde pluripotente stamcellen. De ontdekking dat je volwassen menselijke cellen zo kan programmeren dat ze opnieuw stamcellen worden, kreeg in 2012 de Nobelprijs. Die stamcellen kan je dan doen uitgroeien tot elk menselijk celtype. ‘Dat onderzoek kent nu echt zijn momentum. De focus ligt daarbij meestal op de herstellende geneeskunde, maar wij kunnen zulke cellen ook gebruiken in de toxicologie, onder meer om er organoïde modellen mee te maken. Voor het hart en de hersenen staan we al ver, voor andere organen moet er nog wat onderzoek gebeuren.’
Hoewel je er al interactie tussen stoffen en verschillende celtypes van de lever mee kan testen, blijft een klassiek cultuursysteem volgens Vinken tamelijk statisch. ‘Tegenwoordig bestaan er ook organen op chips. In plaats van het cultuurmedium elke dag te vervangen, laat je het door leidinkjes stromen.’ Dat heet dan een liver on a chip of zelfs een human on a chip. ‘Dat laatste is echt fantastisch om te zien. Lever, hart, longen, allemaal verbonden met die leidinkjes. Maar ook daar is nog heel wat onderzoek nodig.’
Zo’n mens op een chip zou veel voordelen opleveren in toxicologisch onderzoek. ‘Als je een geneesmiddel inneemt, wordt dat opgenomen in je maag en/of je darmen. Dan gaat het naar de lever en daar wordt het omgezet, dat noemen we biotransformatie. Pas dan gaat je geneesmiddel naar de doelwitorganen. De omzetting heeft een enorm effect op de werking van de stof: die kan versterkt worden, of net minder actief. Zoiets kan je veel beter modelleren met een human on a chip.’
Het juiste eten
Moet ik me een levermodel voorstellen als een minilevertje in een petrischaal? ‘Je kan de cellen niet zien met het blote oog, alleen met een microscoop.’ Julen Sanz Serrano neemt ons mee naar de celcultuurlabs. ‘Ik zoek naar medicijnen die ontstekingen verminderen. Ik werk op niet-alcoholische steatohepatitis, leververvetting die gepaard gaat met ontsteking. Het aantal gevallen van deze aandoening stijgt wereldwijd sterk, vooral door obesitas.’
De postdoc toont zijn celculturen. ‘Ik voeg stoffen die ontsteking veroorzaken toe en daarna modelmedicijnen die ze zouden moeten verminderen. En ik kijk hoe de cellen op beide reageren. In een volgende fase ga ik werken met een sferoidmodel met verschillende types van levercellen. Die kan ik dan later controleren in de flowcytometer, of met andere technieken, zoals microscopie. Ik kan bijvoorbeeld kijken of vetten zich in de cellen opstapelen, en of er celdood optreedt.’
‘Celculturen moet je behandelen als kleine mensen: je moet ze het juiste eten en drinken geven’
In het tweede deel van een lab hanteert zijn collega met vaste hand een micropipet. ‘Zij verzet de celculturen in een vers cultuurmedium. Celculturen moet je behandelen als kleine mensen: je moet ze het juiste eten en drinken geven. Levercellen hebben verschillende voedingsstoffen nodig. En je moet regelmatig hun luiers verversen.’
Het lab heeft ook een ruimte voor RNA-onderzoek. Volgens de site van het ONTOX-project werkt Vinken met transcriptomics. ‘We gebruiken dat om de hiaten in onze kennis over hoe stoffen werken op te vullen. Voor je zo’n testbatterij als de onze kan ontwerpen, moet je eerst die mechanismen kennen. We krijgen weefsels van mensen die een bepaalde stof innamen. Daarin kijken we hoe die stoffen genen in- en uitgeschakeld hebben.’
Vinken heeft nog niet over de computermodellen gesproken. ‘We leren de computer toxiciteit herkennen en voorspellen. In het ONTOX-project werken we samen met farmaceutische bedrijven. Die hebben zo’n massa gegevens dat een mens die niet eens zou kunnen doorzoeken.’
Op basis van gegevens over stoffen met bekende toxiciteit maken de computermodellen een signatuur van elke toxiciteit, met mechanistische, klinische en kinetische gegevens. ‘Hoe beweegt de stof door het lichaam en welke processen spelen daar allemaal mee? Welke symptomen veroorzaakt de stof, wat is de epidemiologie ervan? Hoe snel verdwijnt ze uit je lichaam?’
De onderzoeker hoopt in de laatste twee jaar van het project een molecule die goede eigenschappen heeft, met de computer te kunnen testen op toxicologie. ‘Dan hopen we voor die zes schadelijke effecten die we onderzoeken een score te geven: grote kans op toxiciteit, middelmatige kans of lage kans.’ In het project wordt ook een risicomodel opgesteld. ‘Niet elke gevaarlijke stof houdt een risico in. Je moet er eerst aan worden blootgesteld. Een leeuw is gevaarlijk, maar in de dierentuin loop jij weinig risico.’
Anders denken
De hele testbatterij zou dan op een betrouwbare manier toxiciteit van nieuwe chemische stoffen voor mensen kunnen voorspellen. ‘Natuurlijk moeten de Europese regelgevers dan mee willen. Zoals het er nu voorstaat, zouden ze dat wellicht niet accepteren.’ Volgens Vinken zien regelgevers dierproeven vaak nog als de gouden standaard. ‘Je mag nog zo’n fantastisch in-vitromodel hebben, met zulke fancy levertjes: van elk systeem willen ze weten hoeveel beter het presteert dan een dierproef. We proberen hen er dus nu van te overtuigen dat de dierproef zélf niet het best mogelijke is.’
‘Aan de andere kant willen we hen ook doen inzien dat je een dierproef van twee jaar niet kan vervangen door een testje in een petrischaaltje.’ De toxicoloog wil dat wetgevers begrijpen dat het om een hele batterij van testen zal gaan, die bovendien niet morgen klaar is. We doen grote inspanningen, maar we komen nog kennis en gegevens te kort. Om die te verzamelen, heb je tijd en geld nodig. Regelgevers hebben soms onrealistische verwachtingen over de methoden die wij ontwikkelen.’
‘Regelgevers zien dierproeven als de gouden standaard. We proberen hen te overtuigen dat de dierproef niet het best mogelijke is’
Aan de andere kant zijn sommige firma’s en bedrijfstakken volgens Vinken conservatief. ‘Terecht dat ze voorzichtig zijn, het gaat immers om de veiligheid van mensen. Maar ze moeten zich realiseren dat de huidige situatie ook niet feilloos is. Titaandioxide, E171, is sinds kort niet meer toegestaan in voeding in Europa. Hoeveel decennia hebben mensen dat niet binnengekregen?’
Maar er is veel aan het veranderen. ‘Het is een uitdagende periode om te werken in dit onderzoeksveld. Je kan niet meer de eenzame celbioloog in zijn lab zijn, je moet samenwerken met experts in artificiële intelligentie en statistici, met industrie en wetgevers. Enkel zo gaan we er komen, door met alle relevante stakeholders samen te zitten.’
Er moet Vinken nog iets van het hart. Ook wetenschappers die basisonderzoek doen, kunnen bijdragen. De meeste dierproeven gebeuren voor wetenschappelijk onderzoek. ‘Als je een leveronderzoek wil publiceren in een tijdschrift met een hoge impactfactor, moet je vaak twee diermodellen gebruiken.’ Je mag dus niet alleen leververvetting veroorzaken door je ratten westerse voeding te geven, je moet een dubbelcheck doen met een andere manier van leververvetting.
‘Daarmee kom je zo goed als altijd bij hetzelfde resultaat, maar je gebruikt wel dubbel zoveel dieren. Ik ben zelf hoofdredacteur van een toxicologietijdschrift, en ik probeer nu gedaan te krijgen dat we onderzoek met hoogstens één diermodel accepteren en zelfs met volledig in-vitro- of insilico-onderzoek, als dat mogelijk is. Het wordt tijd dat we allemaal anders gaan denken. We kunnen de hete aardappel niet naar elkaar blijven doorschuiven.’
Dit artikel is verschenen in Eos nr. 2, 2023. Koop het nummer hier.
