CRISPR voor DIY-biologen

Het DNA is een soort uitgebreide catalogus waarin alle instructies te vinden zijn die de eigenschappen van een organisme bepalen. Of het nu gaat om de kleur van ogen bij een mens, de vorm van de bladeren bij een plant of het soort antibioticum waartegen een bacterie resistent is, het zijn allemaal kenmerken die vast liggen in de code van het DNA.

Deze code bestaat uit een opeenvolging van 4 bouwstenen of basen, die aangeduid worden met de letters A, T, G en C. In het geval van Escherichia coli, een darmbacterie bij mens en dier die vaak als modelorganisme in het labo bestudeerd wordt, omvat de genetische code meer dan 4,6 miljoen posities of baseparen, terwijl het menselijk genoom opgebouwd is uit ongeveer 6 miljard baseparen. Een fout op slechts één van deze posities, ook wel een mutatie genoemd, kan zorgen voor een ingrijpende verandering in het organisme. Zo zijn verschillende menselijke ziektes een gevolg van mutaties, zoals taaislijmziekte of de ziekte van Huntington. Niet alleen om deze fouten te corrigeren, maar ook om de informatie die in het DNA opgeslagen zit beter te begrijpen, zijn wetenschappers op zoek naar manieren om de genetische code aan te passen. De technieken die tot voor kort beschikbaar waren, bleken vaak zeer tijdrovend en arbeidsintensief. Zo kon het wel enkele maanden tot een half jaar duren om slechts één verandering aan te brengen in het DNA. Tot in 2012 CRISPR op de wereld werd losgelaten...  

Bacteriën kunnen aangevallen worden door virussen. Ze vallen de bacteriën namelijk aan om zich voort te planten. Hierbij injecteert het virus een stukje DNA in de bacterie dat dan alle informatie bevat die nodig is om nieuwe virussen op te bouwen. Om zich te beschermen zal de bacterie dit stuk DNA dus moeten vernietigen nog voor de nieuwe virusdeeltjes gevormd worden. Een tijdje geleden werd ontdekt dat bacteriën zich tegen deze virussen konden beschermen door middel van het CRISPR/Cas systeem. Het CRISPR/Cas systeem is dus eigenlijk niet meer dan het immuunsysteem van bacteriën, zoals ook mensen een immuunsysteem hebben om zich tegen ziekteverwekkers te beschermen.  

Het CRISPR systeem zal eerst en vooral stukjes uit het vreemde virus-DNA halen en inplakken in het eigen DNA. Deze stukjes worden telkens in dezelfde regio in het DNA van de bacterie ingeplakt, ook wel de CRISPR regio genoemd. Deze regio bevat dus een verzameling van stukjes van alle vreemd DNA waar de bacterie al mee in contact is gekomen en kan aangewend worden om later infectie met diezelfde virussen snel te herkennen en onschadelijk te maken. Het stukje DNA dat opgeslagen wordt doet vervolgens dienst als een soort gids voor het Cas9 eiwit, een moleculaire schaar. Cas9 is in staat om het DNA te knippen en wel op een zeer specifieke plaats die volledig bepaald wordt door het stukje dat eerder uit het vreemd DNA werd gehaald. Dus bij een aanval van een virus zal het Cas9 gegidst worden door het reeds opgeslagen stukje DNA van dat virus in zijn CRISPR regio en heel specifiek het geïnjecteerde DNA van dat virus kunnen knippen. De enorm hoge nauwkeurigheid van dit systeem en de mogelijkheid om heel specifiek op een bepaald stuk DNA te knippen bracht onderzoekers een paar jaar geleden op het idee om CRISPR/Cas te gebruiken voor genmodificatie in andere organismen.

Knippen in het DNA voor genmodificatie? Inderdaad, dat klinkt op het eerste zicht een beetje vreemd. Het oorspronkelijke CRISPR/Cas systeem in bacteriën is namelijk bedoeld om DNA weg te knippen. Toch kunnen we dit gebruiken voor genmodificatie. Wanneer het DNA van een organisme geknipt wordt, zal het er alles aan doen om deze breuk te herstellen, zoniet zal het organisme sterven. Dit herstel kan gebeuren door het terug aan elkaar plakken van de twee losse eindjes. Daar treden echter heel wat fouten bij op wat niet gewenst is als je een specifieke verandering wil aanbrengen. Gelukkig kan de cel de breuk in het DNA nog op een andere manier herstellen. Zo kan de cel een voorbeeldstukje DNA gebruiken om de plaats waar geknipt is terug te herstellen. Dit voorbeeldstukje DNA heeft identieke stukken met het oorspronkelijke DNA voor en achter de knipplaats. Daardoor kan het herkend worden en gebruikt worden voor herstel. We kunnen daar als onderzoeker nu zelf gebruik van maken door in dit stukje DNA onze gewenste veranderingen aan te brengen. Op die manier kunnen we één basepaar veranderen, extra stukjes invoegen, stukjes verwijderen of zelfs stukjes van richting veranderen. Zo opent CRISPR/Cas oneindig veel mogelijkheden voor het aanpassen van DNA.  

Uitvinders Emmanuelle Charpentier, Jennifer Doudna en Feng Zhang kwamen op het idee om de CRISPR/Cas moleculaire schaar van de bacteriën te gebruiken om DNA te knippen in andere organismen zoals planten, dieren en mensen. In 2012 kwamen de eerste berichten binnen dat CRISPR/Cas gebruikt kon worden voor het aanpassen van genetisch materiaal in menselijke cellen. Dit was het beginpunt voor de CRISPR-revolutie in de biologie. Onderzoek naar het CRISPR systeem explodeerde in de daaropvolgende jaren en het gebruik van de techniek werd aangetoond in steeds meer verschillende organismen. Vele bedrijven werden opgericht om de techniek te commercialiseren. CRISPR/Cas wordt ook wel de 'Wetenschappelijke ontdekking van de eeuw' genoemd. De impact van CRISPR is zo enorm groot dat zijn uitvinders de afgelopen twee jaar kans maakten op de Nobel prijs, ware het niet dat er ondertussen ook een verwoede patentoorlog tussen hen aan de gang is die moet beslissen aan wie de CRISPR-rechten toebehoren.

Vele menselijke ziektes worden veroorzaakt door mutaties. Met CRISPR zouden deze fouten in het DNA gecorrigeerd kunnen worden. Ook voor verschillende soorten kanker zou CRISPR een oplossing kunnen bieden. Uiteraard staan nog heel wat ethische kwesties het effectief toepassen van CRISPR voor genetische manipulatie van mensen in de weg. Gezien de enorme kracht van CRISPR is het van groot belang dat de techniek enkel kan ingezet worden voor ethisch verantwoorde doeleinden. CRISPR werd wel reeds ingezet voor het aanmaken van gewassen die meer bestand zijn tegen droogte of ziekteverwekkers. Ook algen werden reeds gemanipuleerd voor het optimaliseren van de productie van bio-brandstoffen. Door de brede toepasbaarheid zullen doorbraken in verschillende andere domeinen volgen in de nabije toekomst. 

Het gebruik van CRISPR lijkt eenvoudig. Uiteraard moet je eerst beschikken over de verschillende onderdelen: 

• het Cas9 eiwit dat knipt in het DNA
• het stukje genetische code (gids RNA) dat ervoor zorgt dat Cas9 op de juiste plaats knipt
• het voorbeeldstuk DNA dat gebruikt wordt voor het herstellen van de knip en waarin we de gewenste verandering kunnen aanbrengen.

Dit laatste stukje genetische code bestaat uit zo'n 20 basen en komt perfect overeen met de DNA sequentie waar het Cas9 zou moeten knippen. Om op een bepaalde plaats in het DNA een verandering aan te brengen, moeten we dus enkel die 20 basen zo ontwikkelen dat die overeenkomen met die bepaalde positie.

Maar opgepast, want daar knelt nu net het schoentje. Stel dat elders in het DNA een sequentie aanwezig is waarbij bijvoorbeeld 19 van de 20 basen ook overeenkomen met de ontwikkelde sequentie dan zal het Cas9 daar waarschijnlijk ook knippen. Dit leidt tot ongewenste breuken (ook wel 'off-target effecten' genoemd) op verschillende plaatsen in het DNA. Bij het toepassen in menselijke cellen kan dit levensgevaarlijk zijn en zelfs leiden tot kanker, zoals een paar dagen geleden aangekondigd werd. Bovendien is het ontwikkelen van het voorbeeld DNA voor herstel ook niet eenvoudig. Het Cas9 mag namelijk niet opnieuw knippen op dezelfde plaats na herstel van de eerste knip. Vaak is er heel wat optimalisatie nodig vooraleer een verandering in het DNA aangebracht kan worden. Deze stappen zijn tijdrovend en vormen een drempel voor het gebruik van CRISPR, bijvoorbeeld voor onderwijs doeleinden.

Het Michiels labo van het KU Leuven Centrum voor Microbiële en Plant Genetica en het VIB-KU Leuven Centrum voor Microbiologie heeft een vereenvoudigde CRISPR methode ontwikkeld voor genmodificatie in de bacterie Escherichia coli. Deze methode combineert de CRISPR/Cas techniek met de Escherichia coli Keio collectie. De Keio collectie? Wel, de Keio collectie werd gemaakt door een internationaal team van onderzoekers aan de Keio universiteit in Japan en Purdue universiteit in de Verenigde Staten en werd beschikbaar gemaakt in 2006. Sindsdien werd ze gebruikt voor een heleboel onderzoeken naar de genetica van bacteriën. De verzameling bevat 3985 Escherichia coli varianten. In elk van deze varianten werd één specifiek gen uitgeschakeld door het te vervangen met een antibioticum resistentie gen. Dat wil zeggen dat ieder van deze 3985 varianten diezelfde DNA sequentie van het antibioticum resistentie gen bevat telkens op een verschillende plaats waar oorspronkelijk het verwijderde gen zich bevond. Dat is nu hetgene waar we in onze methode gebruik van hebben gemaakt. 

Bij de klassieke CRISPR methode moet je voor elke nieuwe genmodificatie een nieuw stukje genetische code (gids RNA) ontwikkelen en optimaliseren zodat het Cas9 naar de gewenste plaats gebracht wordt. Aangezien elke variant in de Keio collectie hetzelfde stuk DNA (het antibioticum resitentie gen) bezit, kunnen we het gids RNA zo ontwikkelen dat het Cas9 telkens knipt op die gemeenschappelijke sequentie. Op die manier kunnen we telkens dezelfde onderdelen gebruiken voor het aanbrengen van genmodificaties op verschillende plaatsen. Je kan het eigenlijk beschrijven als een 'one size fits all' methode. Stel, je wilt een verandering aanbrengen in gen X, dan kan je dit in een paar eenvoudige stappen doen:

1. Selecteer de variant uit de Keio collectie waarbij gen X vervangen is door het gemeenschappelijk antibioticum resistentie gen.
2. Activeer het het Cas9 en het stukje gids RNA dat het Cas9 naar de gemeenschappelijke sequentie brengt.
3. Voeg het voorbeeld DNA voor gen X met de gewenste verandering toe, zodat de knip in het DNA hiermee hersteld kan worden.

Het mooie aan de methode is dat het antibioticum resistentie gen helemaal vervangen wordt door het voorbeeld DNA. Hierdoor kan het Cas9 niet meer knippen na het herstel. Bovendien kunnen we ook heel eenvoudig de bacteriën die de verandering in gen X opgenomen hebben herkennen doordat ze niet meer resistent zijn tegen het antibioticum. 

Om deze methode te gebruiken zijn geen tijdsrovende optimalisatie stappen meer nodig. In principe is het mogelijk om op slechts 2 dagen de gewenste genmodificatie te verkrijgen. De methode werd reeds succesvol gebruikt door bachelor en master studenten bio-ingenieurswetenschappen aan de KU Leuven en onderzoekers en studenten aan Baylor College of Medicine (Texas, VS) en McGovern Medical School (Texas, VS). De methode is voorlopig enkel aangetoond in de bacterie Escherichia coli, maar het principe van het knippen op een gemeenschappelijk stuk DNA kan breed toegepast worden in andere organismen waarvoor genetische collecties bestaan, zoals gisten en fruitvliegen.

De vereenvoudigde CRISPR methode werd ontwikkeld door Toon Swings (VIB-KU Leuven) in samenwerking met David C. Marciano (Baylor College of Medicine, Texas, Verenigde Staten) en werd onlangs gepubliceerd in Nature Communications.